HPV疫苗纯化工艺简析

  HPV病毒，一种无包膜的双链环状DNA病毒，当它侵入人体时，会释放其DNA并整合到宿主细胞的细胞核基因组中，这种整合可能诱发癌症的发生。

  HPV病毒颗粒的大小约为45-55纳米，它的衣壳呈现出独特的20面体对称结构，拥有72个壳微粒，由L1蛋白和L2蛋白组成。其中，L1蛋白作为主要的衣壳蛋白，分子量为55-60KDa，是HPV疫苗的关键靶标。此外，L1蛋白无需L2蛋白的协助，就能独自形成与天然病毒颗粒形态结构相似的类病毒颗粒（Virus-Like Particle, VLP）。

  由L1蛋白形成的VLP，保留了病毒颗粒的天然表位，能模拟真实病毒，激活免疫系统，产生针对同型HPV病毒的中和抗体，从而起到预防作用。更值得一提的是，由于VLP并不包含双链环状DNA这一遗传物质，没有办法进行自主复制，因此不具备致病性和传染性，确保了疫苗的安全性。目前，基于VLP的疫苗已成为HPV疫苗研发的主要方向，为预防HPV感染和由其引发的癌症提供了有效的手段。

  HPV疫苗的研发依赖于高效的表达和纯化平台。目前，研发平台主要基于真核表达系统和原核表达系统。

  原核表达系统，尤其是大肠杆菌系统，因其培养成本低、表达量大的优点而被普遍的使用。但原核系统中表达的HPV L1蛋白常以包含体形式存在，需要复杂的复性过程才能得到具有天然构象的VLP，这样的一个过程中蛋白损失量大，收率比较低。

  真核表达系统有酵母、昆虫细胞和痘病毒表达系统，能够表达具有天然构象的HPV L1蛋白，易于形成病毒样颗粒（Virus-Like Particles, VLPs），操作比较简单。

  目前第二代的酵母（毕赤酵母）表达系统，兼具原核以及真核表达系统的优点，可高水平表达蛋白，且表达的HPV抗原与人类的细胞结构更为接近，因此免疫原性更强。

  目前，国内已有多款HPV疫苗成功获批上市，其中，1款采用大肠杆菌表达系统，1款为杆状病毒/昆虫细胞表达系统，3款采用酵母表达系统。尽管表达系统不同，但都一定要通过纯化获得高纯度、高活性的L1蛋白，从而自组装形成VLP。

  为了获得高纯度VLP颗粒，常常要加入还原剂（如DTT或β巯基乙醇），打开二硫键，使得蛋白充分解聚，还原得到L1蛋白单体，同时释放有几率存在于VLP内部的HCP和核酸。然后慢慢地去除还原剂及其他杂质，使得目的L1蛋白组装成VLP。

  针对HPV L1蛋白的纯化工艺，目前已开发了多种方法，可采用阳离子进行捕获，在通过1-2步精纯，可采用疏水、复合模式、阴离子或凝胶过滤进行精纯，纯度可达到98%以上，自组装后拥有非常良好的免疫原性。

  离子交换层析：利用HPV L1蛋白在特定pH和盐浓度下的电荷特性，通过阳离子或阴离子交换层析能轻松实现进一步的纯化。例如，使用NanoGel-50SP HP阳离子交换介质具有高载量，同时该介质具有高耐盐性，支持在中等离子强度下大量捕获L1蛋白，有效去除杂蛋白; NW Rose Plus Q HP阴离子交换层析介质可用于精纯阶段，去除内毒素及痕量杂质。

  复合模式层析（羟基磷灰石）：NMCHT Type II羟基磷灰石层析介质具备超大孔径，拥有金属亲和阳离子交换能力，可用于HPV纯化捕获或精纯阶段，L1蛋白可与层析介质结合，有效去除杂蛋白和宿主DNA等。

  疏水相互作用色谱：在疏水相互作用色谱中，HPV L1蛋白根据其疏水性被分离。例如，使用NW Rose Butyl FF疏水相互作用层析介质可以在高盐条件下洗脱杂蛋白，而目的蛋白在较低盐浓度下洗脱，以此来实现高纯度的HPV L1蛋白纯化。

  凝胶过滤层析：NW Rose 4FF/NW Rose 6FF凝胶过滤层析介质可进一步用于杂蛋白的去除。

  NanoGel-50SP HP是一款高性能耐盐阳离子交换层析介质，利用杂蛋白、宿主DNA和目的蛋白电荷性质差异，与填料的结合程度不同，洗脱顺序不同，可用于大量高效捕获。下图是利用NanoGel-50SP HP从澄清溶包产物中高效捕获目的HPV L1蛋白的案例，通过盐浓度梯度洗脱，可以轻松又有效分离杂质。

  纳微NMCHT Type II以更大的孔径设计，为HPV的分离纯化提供了显著的优势。在实验中，我们选用了某进口品牌的CHT II和纳微NMCHT Type II两种介质对HPV进行纯化。实验结果为，纳微NMCHT Type II介质在分离纯化过程中表现出色，宿主杂质被直接流穿，且最终的收率相较于某进口品牌提高了8.32个百分点。

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